Fler kemi/biomedicin frågor - Kolozzeum Forum

tessi · 2004-10-26, 18:44

Nu har jag problem igen...
Hur gör man för att extrahera vävnad? Jag vet att ett sätt är att ta sönder cellerna genom att frysa och tina flera gånger. Hur kan man annars göra?

Sverker · 2004-10-26, 19:27

Vilken vävnad ? Lever, njure, muskel ?

Vad skall du ta fram ? Enzymer ? DNA ?

Finns höghastighetskvarnar, 20 000 rpm med en spaltbredd mindre än en cell men stor nog för att inte mosa mitokondrierna.

Centrifugera, i kylcentrifug, ned cellrester och annat skräp och ta tillvara supernatanten= extraktet ?

tessi · 2004-10-26, 20:43

Jag läser en artikel där de ska extrahera mucosa (slemhinna?).
Det är Cathepsin aktiviteten som ska undersökas.
I avsnittet om extraktionen av vävnaden så står det att de använde E-64 men det har väl ingenting med extraktionen att göra. Används det inte för att inaktivera enzym ( i detta fall Cathepsin)

Styx · 2004-10-26, 20:45

Tja...extrahera vävnad kan man ju göra på många sätt. Förstår heller inte riktigt vad du tänkt göra?
Vad ska du ha den extraherade vävnaden till? Låter som att du är ute efter något i cellerna eftersom du pratar om att ta sönder cellerna? Men då handlar det ju inte om att extrahera vävnad längre.
Det sättet du beskriver för att ta sönder cellerna kallas ibland freeze-thawing,
vanligast är annars att man använder nåt recept för en lyseringsbuffer. Dessa innehåller reagens som lyserar cellerna och ofta även proteasinhibitorer och annat som hjälper till att hindra cellkomponenterna från att brytas ner (eller proteinerna från att denatureras).
Eller menar du att göra en biopsi (extrahera vävnad)?
Eller göra ett mikroskopi-preparat?

Styx · 2004-10-26, 20:51

Citat:

Ursprungligen postat av tessi

Jag läser en artikel där de ska extrahera mucosa (slemhinna?).
Det är Cathepsin aktiviteten som ska undersökas.
I avsnittet om extraktionen av vävnaden så står det att de använde E-64 men det har väl ingenting med extraktionen att göra. Används det inte för att inaktivera enzym ( i detta fall Cathepsin)

Ok,
Cathepsin är ett proteas, i den situation jag stött på det är att det är involverat i att förbereda antigen i cellers endosomer för laddning på MHC typ II molekyl.
Mukosa är slemhinna, ja.
Vet inte vad E-64 är, men kan försöka ta reda på det

.

Styx · 2004-10-26, 20:54

Men förresten

.
Jag har ju nästan redan svarat på det,
om E-64 är en proteasinhibitor som du skriver är det ingen dum idé att använda det för att inhibera cathepsin som är just ett proteas. Som jag tidigare skrev är det ju bra vid extraktion att inhibera proteas så de inte går lös på alla cellrester. Studera dess aktivitet antar jag att de vill göra under mer kontrollerade former.

LunaSpice · 2004-10-30, 09:25

Biopsier tycker jag borde vara ett enkelt sätt.

tessi · 2004-11-04, 13:24

Nu har jag fler problem... Enzym aktiviteten i prov ska mätas med hjälp av en fluorometer. Jag antar att en fluorometer mäter flouroscerande strålning men hur fungerar det? Mäter man vid flera våglängder?

jojje.net · 2004-11-04, 13:35

Oftast räcker det med en våglängd... 490 nm är rätt vanligt men beror ju på vad du använder för fluoroserande ämne.

tessi · 2004-11-04, 13:56

Substrat som användes innehåller arg-arg-MCA
MCA = 4-metylcoumaryl-7-amide. Som jag förstår så om enzymet spjälkar substartet så utsändes fluoroscerande ljus. Tror inte någon annan sluoeoscent är tillsatt.

Hur fungerarsjälva apparaten? Mäter man på plattor typ ELISA eller i kyvetter?

Styx · 2004-11-04, 14:11

Det finns ju flera apparater man kan använda, vanligt är ju dock att använda en sån som passar för 96-håls plattor, alltså det du menar med ELISA-plattor.
Då har man ju gott brunnar där man kan låta reaktioner gå. Men då tror jag mer man mäter absorbans och inte själva fluorescensen. Man mäter alltså ex hur mycket ljus av viss våglängd som absorberas, optisk densitet.
För fluorecens innebär det ju ofta att man bestrålar en kyvett med en kort ljuspuls av viss våglängd, fluorescensen är sen den strålning som kommer tillbaka från ämnet med en fördröjning på nån nanosekund. Man exciterar elektroner hos ämnet och när relaxation sedan sker skickas ljus ut av en annan våglängd.
Men om substratet avger ljus av sig tror jag nog ni kör i 96-håls plattor istället för nån kyvett.

Berätta gärna mer vad exakt ni ska göra?
Vad pluggar du för nåt?

Sverker · 2004-11-04, 14:13

Själv är jag " Wow en ny apparat på labbet, på den bara " i första läget. efter en stund blir det " hmm....var f-n är manualen ".

Läs manualen.

Hittade snabbt denna sida:

http://www.jbc.org/cgi/content/full/278/34/32292

Här sitter den fluoricerande molekylen på en annan peptid men den belyses vid 380 nm och skickar tillbaka ljus vid 460 nm.

Gissar att du också ligger nära de våglängderna.

Styx · 2004-11-04, 14:29

Letade lite på MCA på nätet.
Ett fluorescerande ämne är fäst på en kort peptid och klyvning av ett peptidase på ett visst ställe frigör det substrat som fluoroscerar vid belysning av viss våglängd. I texten jag läste var det 350nm för att excitera och då kom fluorescensen på 460nm.
Jag är ganska säker på att ni använder kyvetter i fluoroscensmaskiner då. Den måste kalibreras (nollas) mot en kyvett med tex bara substratet. Sen gissar jag att ni tillsätter enzym med detta substrat och låter reaktionen gå samtidigt som ni mäter fluorescens vid olika tidpunkter.

tessi · 2004-11-04, 14:51

Citat:

Ursprungligen postat av Styx

Det finns ju flera apparater man kan använda, vanligt är ju dock att använda en sån som passar för 96-håls plattor, alltså det du menar med ELISA-plattor.
Då har man ju gott brunnar där man kan låta reaktioner gå. Men då tror jag mer man mäter absorbans och inte själva fluorescensen. Man mäter alltså ex hur mycket ljus av viss våglängd som absorberas, optisk densitet.
För fluorecens innebär det ju ofta att man bestrålar en kyvett med en kort ljuspuls av viss våglängd, fluorescensen är sen den strålning som kommer tillbaka från ämnet med en fördröjning på nån nanosekund. Man exciterar elektroner hos ämnet och när relaxation sedan sker skickas ljus ut av en annan våglängd.
Men om substratet avger ljus av sig tror jag nog ni kör i 96-håls plattor istället för nån kyvett.

Berätta gärna mer vad exakt ni ska göra?
Vad pluggar du för nåt?

Detta handlar om en artikel som jag ske redovisa där de ska rena fram och karaktisera ett endoproteas. http://www.jbc.org/cgi/content/full/270/14/7809

Jag ska alltså inte göra detta själv men hade aldrig tidigare hört om en fluorometer och blev nyfiken.

Jag läser till biomedicinsk analytiker. Vad läser du som verkar kunna lite av varje inom kemi o medicin??

Styx · 2004-11-04, 16:08

Ok, jag läser biomedicinprogrammet, nåt som många förväxlar med biomedicinsk analytiker fastän skillnaden faktiskt är ganska stor.

Kursmässigt är det en blandning mellan läkarprogrammet och molekylärbiologiprogrammet brukar jag säga.

Hoppas du fick svar på dina frågor angående artikeln, bara fråga på annars, kul att försöka hjälpa till.